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基于MS的蛋白质生物标记物定量的新型凝胶电泳方法

质谱(MS)是一种用于生物标志物分析的强大方法,因为它可以对临床样品中的目标分子进行高度灵敏和准确的测量。MS在临床诊断(例如新生儿代谢筛查)中的应用已经取得了进展,重点是代谢物标记物。蛋白质的质谱测量目前主要用于新型标记物发现研究,但作为免疫测定的替代方法,其在临床标记物诊断中的应用越来越引起人们的兴趣。

基于MS的蛋白质生物标志物定量方法主要是通过自下而上的方法进行的,该方法使用的肽片段是通过胰蛋白酶消化酶蛋白而获得的。标准消解方案需要超过20小时的反应时间,这是样品制备工作流程中的限速因素。

在这项研究中,我们专注于使用N,N'-双(丙烯酰基)胱胺(BAC)作为交联剂的可溶性聚丙烯酰胺凝胶来解决这些问题。BAC交联聚丙烯酰胺凝胶易于通过还原处理溶解,从而可以回收逃逸到溶液中的蛋白质。我们发现回收的蛋白质适合在高温条件下快速进行胰蛋白酶消化,并且我们成功建立了用于基于MS的生物标记定量的高通量样品制备方法,我们将其命名为BAC-DROP(BAC-Gel Dissolution to Digest PAGE) -解析的目标蛋白质)。尽管通过MS进行蛋白质定量非常敏感,但血浆和血清蛋白质组却非常复杂,其他成分的干扰也构成了重大挑战。对于目标标记的高精度检测,已经报道了预先去除主要血清蛋白成分(例如白蛋白)或使用抗体柱选择性富集目标标记的方法,但是脱靶对定量结果的影响和处理多个目标的难度样品仍然是障碍。

使用BAC-DROP进行高分辨率蛋白质组分离对于从临床样品中获得的目标痕量标记蛋白的MS定量分析特别有效。通过将BAC-DROP引入炎性生物标志物C反应蛋白(CRP)的基于MS的定量工作流程中,我们能够在5小时内完成样品预处理,并成功地从0.5μL人血清样品中定量了CRP。我们还通过HBsAg定量结合BAC-DROP和MS成功地进行了乙型肝炎病毒(HBV)感染的血清学诊断。近来,对MS诊断病毒感染的兴趣迅速增加,如COVID-19的诊断所证明的。本研究中显示的BAC-DROP高通量样品制备方法不仅适用于HBV,还适用于其他传染性病毒疾病样品。

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